小鼠Ⅱ型膠原(ColⅡ)ELISA試劑盒

檢測原理

試劑盒采用雙抗原一-步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 。往預先包被病毒性腹瀉病毒抗ti的包被微孔中，依次加入標本、HRP標記的檢測抗原，經(jīng)過(guò)溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在suan的作用下轉化成最終的黃色。用酶標儀在450NM波長(cháng)下測定吸光度(OD值) ，與CUTOFF值相比較，從而判定標本中豬病毒性腹瀉病毒(BVDV) 的存在與否。

樣品收集、處理及保存方法

1.血清:使用不含熱原和內毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.血漿: EDTA、檸檬suan鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。

3.細胞上清液: 3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉 離心10分鐘取上清。

5.保存:如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20°C， 避免反

復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

操作注意事項

1.試劑盒保存在2-8°C，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì )有結晶，這屬于正?，F象，水浴加熱使結晶完quan溶解后再使用。

2.實(shí)驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封(低溫干燥)保存。

3.預處理后的樣本請按照操作步驟用樣ben稀釋ye適當稀釋以達到試劑盒的的最jia檢測效果。.

4.嚴格按照說(shuō)明書(shū)中標明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.所有液體組分使用前充分搖勻。

小鼠Ⅱ型膠原(ColⅡ)ELISA試劑盒

常用方法：

1. 夾心法：

夾心法常用于檢測大分子抗原，一般的操作步驟為:

a. 將具有專(zhuān)一性的抗ti固著(zhù)（coating）于塑膠孔盤(pán)上，完成后洗去多余抗ti

b. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的抗原，則其會(huì )與塑膠孔盤(pán)上的抗ti進(jìn)行專(zhuān)一性鍵結

c. 洗去多余待測檢體，加入另一種對抗原專(zhuān)一的一次抗ti，與待測抗原進(jìn)行鍵結

d. 洗去多余未鍵結一次抗ti，加入帶有酶的二次抗ti，與一次抗ti鍵結

e. 洗去多余未鍵結二次抗ti，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結果

原理：針對抗原分子上2個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗ti分別作為固相抗ti和酶標抗ti，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物。

2. 間接法

間接法常用于檢測抗ti，一般的操作步驟為：

a. 將已知的抗原固著(zhù)于塑膠孔盤(pán)上，完成后洗去多余的抗原。

b. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的一次抗ti，則其會(huì )與塑膠孔盤(pán)上的抗原進(jìn)行專(zhuān)一性鍵結。

c. 洗去多余待測檢體，加入帶有酶的二次抗ti，與待測的一次抗ti鍵結。

d. 洗去多余未鍵結二次抗ti，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測定塑膠盤(pán)中的吸光值（OD值），以評估有色終產(chǎn)物的含量即可測量待測抗ti的含量。

原理：利用酶標記的抗抗ti以檢測已與固相結合的受檢抗ti。

3. 競爭法

競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制，一般用于檢測小分子抗原，其操作步驟為：

a. 將具有專(zhuān)一性的抗ti固著(zhù)于塑膠孔盤(pán)上，完成后洗去多余抗ti

b. 加入待測檢體，使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤(pán)上的抗ti進(jìn)行專(zhuān)一性鍵結

c. 加入帶有酶的抗原，此抗原也可與塑膠孔盤(pán)上的抗ti進(jìn)行專(zhuān)一性鍵結，由于塑膠孔盤(pán)上固著(zhù)的抗ti數量有限，因此當檢體中抗原的量越多，則帶有酶的抗原可鍵結的固著(zhù)抗ti就越少，亦即，兩種抗原皆競相與塑膠孔盤(pán)上抗ti鍵結，即所謂競爭法之由來(lái)。

d. 洗去檢體與帶有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，當檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤(pán)內留下之帶有酶的抗原越少，顯色也就越淺。

e. 當需要偵測無(wú)法獲得兩種以上單一性抗ti的抗原，或是不易得到足夠的純化抗ti以固著(zhù)于孔盤(pán)上時(shí)，一般會(huì )考慮使用競爭法ELISA。

實(shí)驗過(guò)程:

1.試劑準備:所有試劑都必須在使用前達到室溫,使用后請立即按照說(shuō)明書(shū)要求保存試劑。實(shí)驗操作中請 使用一次性的吸頭,避免交叉污染。

2.加樣:加樣或加試劑時(shí)，請注意在吸取標本/標準品，酶結合物或底物時(shí)，第yi個(gè)孔與最hou-一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì )導致不同的“預孵育“時(shí)間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時(shí)間(包括標準品及所有樣品) 將控制在10分鐘內,如標本數量多,推薦使用多道移液器加樣。

3.孵育:為防止樣品蒸發(fā),試驗時(shí)將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā);洗板后應盡快進(jìn)行下步操作,任何時(shí)侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài):同時(shí)應嚴格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。

4.洗滌:洗滌過(guò)程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最hou的酶標儀讀數。