大鼠淋巴成纖維細胞

大鼠淋巴成纖維細胞需要準備好細胞所要用到的培養基和相關(guān)試劑，雖然所有的貼壁，半貼壁或者懸浮細胞處理方式差不多，但是不同的實(shí)驗室培養條件和處理力度還有試劑的批間差這些問(wèn)題存在，也會(huì )導致對細胞處理不當，  或者環(huán)境的不適應而造成細胞的死亡。
大鼠淋巴成纖維細胞培養物的生理環(huán)境不同時(shí)定義為其物理化學(xué)環(huán)境中，更好地理解血清的組件，所必需的增殖的生長(cháng)因子的鑒定，并更好地理解細胞在培養的微環(huán)境（即，細胞 - 細胞相互作用，氣體的擴散，與基質(zhì)相互作用）現在允許在無(wú)血清培養基中某些細胞系的培養。
培養物的主要優(yōu)點(diǎn)是操縱物理化學(xué)（即，溫度，pH，滲透壓，O2和CO2張力）和生理環(huán)境（即，激素和營(yíng)養物濃度），其中所述細胞繁殖的能力。除溫度，將培養環(huán)境是由生長(cháng)培養基進(jìn)行控制。
對于培養，只要我們細心操作，注意細節，并不是大家說(shuō)的那樣困難。對于有經(jīng)驗和有條件的客戶(hù)，建議由公司代為培養細胞及進(jìn)行后續研究。

細胞復蘇技術(shù)：

1. 取出細胞，迅速放入37℃溫水中快速解凍

2. 吸出細胞懸液,并加10倍以上培養液

3. 1000r/分鐘離心5分鐘，去除上清

4. 用培養液適當稀釋后接種培養瓶,放入37℃ CO2培養箱靜置培養

5. 鏡檢細胞貼壁能力，次日更換一次培養液,繼續培養

培養方法：

收到細胞后，在倒置顯微鏡下觀(guān)察整個(gè)細胞生長(cháng)情況：

如果細胞未長(cháng)滿(mǎn)，用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到超菌臺內，嚴格無(wú)菌操作，打開(kāi)細胞培養瓶，留10ml培養液繼續培養。

如果細胞已長(cháng)滿(mǎn)（達80-90%）。即可進(jìn)行傳代，具體步驟如下：

a，棄去培養液，用PBS洗1-2次。

b，向瓶?jì)燃尤?.0-2.0ml酶液，在倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞消化情況，若細胞大部分變圓，迅速拿回操作臺，吸取酶，加含有6ml 含10%血清的培養液，輕輕吹打細胞。

c，加入等量的的培養液，輕輕吹打混勻后吸出一半，分到新的培養

d，傳代比例：1:2-1:3

保存和應用：

客戶(hù)可以根據自己的需求選擇新鮮或者凍存的原代細胞，如是新鮮原代細胞，客戶(hù)收到細胞后應立即將其放入CO2細胞培養箱內靜置后2-3h，再進(jìn)行后續的實(shí)驗操作。如是凍存細胞，客戶(hù)收到細胞后應立即將其放入液氮、-80℃冰箱或立即進(jìn)行復蘇。

細胞復蘇的原則：

在實(shí)際操作中，凍存細胞要進(jìn)行復蘇，再培養傳代。復蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細胞內，再次形成胞內結晶損傷細胞。

1）該細胞只能用于科研，不得用于臨床。

2）收到細胞后首先觀(guān)察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液、渾濁等現象，若有上述現象發(fā)生請及時(shí)和我們聯(lián)系。

3）仔細閱讀細胞說(shuō)明書(shū)，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養基、血清比例、所需細胞因子等。

4）用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀(guān)察細胞狀態(tài)。因運輸問(wèn)題貼壁細胞會(huì )有少量從瓶壁脫落，將細胞置于培養箱內靜置培養過(guò)夜，隔天再取出觀(guān)察。此時(shí)多數細胞均會(huì )貼壁，若細胞仍不能貼壁請用臺盼藍染色測定細胞活力，如果證實(shí)細胞活力正常，請將細胞離心后用新鮮培養基再次貼壁培養；如果染色結果顯示細胞無(wú)活力，請拍下照片及時(shí)和我們聯(lián)系，信息確認后我們?yōu)槟倜赓M寄送一次。

5）請客戶(hù)用相同條件的培養基用于細胞培養。培養瓶?jì)榷嘤嗟呐囵B基可收集備用，細胞傳代時(shí)可以一定比例和客戶(hù)自備的培養基混合，使細胞逐漸適應培養條件;建議直接購買(mǎi)我司提供的培養基。

6）建議客戶(hù)收到細胞后qian3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。

細胞培養操作

1）復蘇細胞：將含有1 mL細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養基的培養瓶中培養過(guò)夜（或將細胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養基，培養過(guò)夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養。

a、棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液培養瓶中，使消化液浸潤所有細胞，將培養瓶置于37℃培養箱中消化1-2 min（視細胞情況而定），然后在顯微鏡下觀(guān)察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加2-3ml培養基終止消化。輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養液后吹勻。

c、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養基的新皿中或者瓶中，置于培養箱中培養。

3）細胞凍存：待細胞生長(cháng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細胞凍存。下面 T25 瓶為例；

a、收集細胞，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細胞計數。

b、根據細胞數量加入無(wú)血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

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