深度剖析ELISA試劑操作常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

一、為什么所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫后再進(jìn)行加樣操作？

溫度是ELISA試劑盒結合反應的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應，實(shí)驗前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫，包括檢測樣本。避免因溫度的動(dòng)力學(xué)反應差異而導致ELISA檢測結果的不準確。

二、如何獲得良好線(xiàn)性的標準曲線(xiàn)？

按照推薦方式保存標準品；溶解標準品之前需短暫離心，收集粉末；確保標準品溶解和混勻（大約10min），然后再進(jìn)行后續的系列稀釋步驟，確保每一步都充分混勻且精確移液；顯色的恰當終止；選擇合適的數學(xué)擬合方程繪制標準曲線(xiàn)。

三、ELISA實(shí)驗為什么必須設置復孔？

為獲得更準確的實(shí)驗結果，強烈建議標準品及樣本進(jìn)行復孔檢測。因為復孔檢測可以：

計算平均值，確保實(shí)驗結果更準確；

解決實(shí)驗中誤操作造成的跳孔現象；

計算CV值，對實(shí)驗的操作和試劑盒的精密度進(jìn)行評估。

四、為什么實(shí)驗過(guò)程中孵育、洗滌需要振蕩？如何振蕩？

振蕩孵育使反應更充分，振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標專(zhuān)用96孔微孔板振蕩器。

孵育過(guò)程振蕩，可以加快、加強抗原抗體分子間的相互碰撞接觸，使得反應過(guò)程更加完善，OD值通常會(huì )比未振蕩孵育的結果要高；洗滌過(guò)程振蕩，可以使洗板更干凈，在很大程度上 能降低背景值，同時(shí)可以提高試劑盒檢測的靈敏度。

五、何時(shí)終止ELISA反應？

ELISA實(shí)驗最終需要酶催化底物顯色反應來(lái)完成，實(shí)驗成功的重要因素。在HRP-TMB酶促反應系統中，S5出現淡藍色，S1 – S3有明顯的階梯型藍色，便需要終止反應；或者根據最高濃度標準品孔在620nm的OD值來(lái)決定，OD620=0.9-0.95之間時(shí)即可終止。

六、為什么酶標儀讀數時(shí)必須選用雙波長(cháng)？

首先，酶標儀使用前務(wù)必預熱10-15min，使測讀結果更穩定。其次，ELISA實(shí)驗采用雙波長(cháng)測定吸光度，可以排除單波長(cháng)檢測時(shí)的測定干擾（標本的濃度，干擾色等）。一般采用最大波長(cháng)作為參照波長(cháng)，在參照波長(cháng)下，檢測物的吸光值最小，檢測波長(cháng)和參照波長(cháng)的吸光值之差可以消除非特異性吸收；因此，雙波長(cháng)測定，可最大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對酶標儀讀數帶來(lái)的誤差，以保證實(shí)驗數據的準確度。

以上是深圳瑞清生物ELISA試劑盒操作常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案，望對您的科研事業(yè)提供幫助！

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